环黄芪醇是一种来源于黄芪的三萜化合物，已被证明具有多种药理作用，包括激活端粒酶、抗衰老和抗阿尔茨海默病作用。目前，环黄芪醇的商业化生产主要依赖于从药用植物黄芪中提取，然而，植物种植易受环境因素的影响，如气候、土壤条件等；环黄芪醇的结构复杂，其化学合成需要多种化学试剂，导致生产成本高，收率低等；酶催化法使黄芪甲苷生成环黄芪醇虽然具有较高的转化率，但面临着黄芪中黄芪甲苷含量低以及糖苷键的非特异性水解等挑战。为了满足日益增长的药用需求，急需开发一种绿色和可持续的环黄芪醇合成策略。
郑州大学药学院和郑州大学合成生物学实验室相关团队在Engineering Microbiology上发表了题为“Production of cycloastragenol in metabolically engineered yeast”的研究成果（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2667370325000414）。该研究通过细胞区室化、引入异源基因等策略构建了一株生产环黄芪醇的工程酵母菌株，成功实现了环黄芪醇的异源合成，证明了酵母生产高价值的活性药物分子的潜力，为其他天然活性分子的异源合成提供了策略。
https://doi.org/10.1016/j.engmic.2025.100227.
(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2667370325000414)
1. 酿酒酵母过氧化物酶体内重构MVA途径
酿酒酵母已被广泛用于合成各种植物活性天然产物的微生物底盘，包括稀有人参皂苷、可可脂和美迪紫檀素等。在真核系统中，过氧化物酶体是促进脂肪酸β氧化的关键细胞器，可以产生大量乙酰辅酶A。乙酰辅酶A是类异戊二烯和萜类生物合成的重要前体。甲羟戊酸（MVA）途径将乙酰辅酶A转化为异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），它们是多种三萜类化合物的通用前体。在这项研究中，我们改造了酿酒酵母IMX581，并在其过氧化物酶体内重构MVA途径（图1）。
图1：工程酵母中环黄芪醇的异源合成。
通过在酿酒酵母IMX581中过表达MVA途径基因，构建了五个工程菌株（CycZ01-04和CycZ07）（图2A）。通过过表达ERG10、IDI1、ERG1和ERG20F96C分别构建了菌株CycZ01、CycZ02和CycZ03。与IMX581菌株对比，角鲨烯的滴度没有显著增加（图2B和2C）。N-末端截短的HMG1基因（tHMG1）的过表达可以改善酿酒酵母中各种萜类化合物的合成。CycZ04菌株过表达了tHMG1，可以产生507.04±177.97 mg/L的角鲨烯（图2B和2C）。进一步过表达ERG13、ERG12、ERG9、ERG19和ERG8，构建了菌株CycZ07，角鲨烯滴度约为656.55±154.32 mg/L（图2C）。这些结果表明，在酿酒酵母过氧化物酶体内重构MVA途径增强了萜类生物合成前体-角鲨烯的积累。
图2：过氧化物酶体中重构MVA途径增加了角鲨烯的积累。
2. 环黄芪醇前体-环阿屯醇的异源合成
角鲨烯被内源性ERG1催化产生2,3-氧化角鲨烯。来源于黄芪的AmCAS1可以催化2,3-氧化角鲨烯转化为环阿屯醇（图3A）。经过120小时的发酵后，CycZ12产生了2.77±0.19 mg/L的环阿屯醇（图3B和3C）。乙酰辅酶A合酶由ACS1和ACS2编码，催化乙酸产生乙酰辅酶A。ACS基因的过表达可以增加酿酒酵母中乙酰辅酶A的水平，进一步促进萜类产物的积累。只过表达了ACS2的CycZ20菌株可以产生的环阿屯醇的滴度明显高于CycZ18和CycZ19，达到4.43±0.93 mg/L（图3C）。这表明过氧化物酶体中ACS1的过表达可能会影响环阿屯醇的滴度。尽管CycZ20的DCW略低于CycZ18和CycZ19，但CycZ20产生环阿屯醇的滴度为0.37±0.08 mg /g DCW（图3D），显著高于其他菌株。此外，发酵后菌株CycZ12、CycZ18、CycZ1 9和CycZ20的DCW没有显著差异（图3E和3F）。内源性ACS2的过表达促进了乙酰辅酶A的积累，ERG1和AmCAS1的表达促进角鲨烯转化为环阿屯醇。
图3：在工程酵母中异源合成环阿屯醇。
3. 环黄芪醇的异源合成
环阿屯醇在C-6、C-16和C-25处发生羟基化，在C-20和C-24处发生环氧化，形成五元环，最终产生环黄芪醇。以CycZ20为底盘，通过引入黄芪来源的AmCYP88D25、AmCYP88D7、AmCYP71D756和AmOGD1，构建了CycZ23菌株（图4A）。发酵120小时后，通过HPLC和HRMS测定，CycZ23菌株产生环黄芪醇（图4B和4F）。在摇瓶中优化发酵条件后，CycZ23菌株可以产生1.04±0.01 mg/L（图4C）和0.09±0.01 mg/g DCW（图4D）的环黄芪醇。这些结果表明，过氧化物酶体中MVA途径的重建以及异源基因AmCYP88D25、AmCYP88D7、AmCYP71D756和AmOGD1的引入实现了酵母中环黄芪醇的从头合成。
图4：工程酵母中合成环黄芪醇。
4. 总结
在本研究中，使用细胞区室化策略、强化前体供应以及引入异源基因等策略实现了环黄芪醇在酵母中的合成。然而，工程酵母菌株中环黄芪醇的滴度、生产率和产量仍然不够理想。CYP450酶的低活性可能导致环黄芪醇生产效率较低。为了进一步提高环黄芪醇产量，应进行细胞色素P450还原酶的共表达和CYP450酶N端序列的优化等改造。
